随着我国2022年北京—张家口冬季奥林匹克运动会的申办成功，全国备战冬奥的准备正如火如荼的开展。目前我国冬奥项目在运动能力开发[1]。生物学监控[2]及运动损伤[3]等方面的研究较为广泛，其中基因对运动能力的作用更是当今研究的热点话题。随着分子生物学研究的开展，基因组文库的构建成为现代生命科学研究的一项重要手段，其中cDNA文库作为研究功能基因的手段之一，引领功能基因组学的研究[4]。cDNA文库是指以细胞或组织中全部mRNA经反转录后形成cDNA，与载体连接后转化受体菌形成的重组DNA克隆群，现已广泛应用于基因的识别和剪接变异体，以及作为全长基因克隆和大规模转录组测序的重要基础，是大规模获得基因序列信息，了解基因编码蛋白相互作用关系和开展功能基因组研究的重要途径[5-6]。时至今日，运动科学领域研究已不拘泥于生物学监控、技术动作分析、运动损伤与心理调控等方面，近年来随着基因组学、蛋白组学及代谢组学等学科的相继兴起，使得通过生物技术手段对运动员进行研究成为了当今研究的热点[7-8]，标志着运动科学领域进入到了“运动分子生物学”这一新时代。以往研究表明，个体之间运动能力差异受多种因素影响，其中环境和遗传因素在个体间运动能力的差异方面起很大程度作用[9]，为了更为深入的研究巅峰状态下运动员机体相关基因表达水平，cDNA文库的应用将有效解决遗传资源与环境和训练干预之间的矛盾，反映特定组织或细胞某一阶段或功能状态下所有的遗传信息，从而在转录组水平研究基因结构与功能，揭示特定生物学过程的分子机制。截至目前cDNA文库构建在其他领域应用较为广泛，但在运动科学中的研究却鲜有报道，故本文结合近年来不同cDNA文库构建方法、特点及应用价值进行综述，以期为优秀运动员的遗传资源利用提供一条新的有效途径，并为我国2022年冬奥会备战期间的运动选材及运动能力开发，开展运动基因功能研究指明方向和提供理论依据。

1　全长cDNA文库构建方法概述

自1976年首例cDNA文库问世至今，cDNA文库构建方法层出不穷，而关于全长cDNA文库构建的报道则直至18年后才由日本科学家Kato等人在研究中首次提及[10-11]。随着分子克隆技术的快速发展，构建全长cDNA文库的手段。效率与质量也发生了很大程度的改善，现根据几种具有代表性的全长cDNA文库构建方法、原理和特点进行概述，从而对其作出客观的评价与分析。

1.1　SMART法

利用SMART(Switching Mechanism At 5'end of the RNA Transcript)法构建全长cDNA文库最早于1996年由Chenchik等学者提出，后经Clonetech公司对其技术进行改进并得以推广，该技术主要原理是依据全长cDNA的合成是借助Powerscript TMRT的末端转移酶活性来实现的[12-13]。由于mRNA3’末端具有特异的polyA尾结构，反转录时利用一个Oligo(dT)与其发生特异性结合，从而引导ss–cDNA的合成，当反转录进行到mRNA5’端帽子结构时，PowerscriptTM RT活性才能达到最佳效果，能够在fi rst–strand cDNA的3’末端添加上一段寡聚核苷酸序列Oligo(dC)，进而保证全长cDNA的完整性。因为用于合成cDNA第二链的引物只能结合3’端含Oligo(dC)的全长cDNA，不能与短片段cDNA结合，因而最终得到的是全长的ds–cDNA，从而保证后续全长cDNA的完整性[4，14]。而对于非全长的cDNA而言，因反转录无法延伸到mRNA5’末端，反转录便不能在其3’末端加上Oligo(dC)，所以在合成第二链时引物便不能与第一链模互不结合，所以便得不到全长的cDNA，具体实验流程[4]如图1所示。

不仅如此，SMART技术优势在于实验过程中在双链cDNA引物的5’端引入Sfi I A–Sfi I B识别位点，所以只需对目的cDNA进行Sfi I单酶切，便可实现目的基因的定向克隆。与其他方法相比，该技术的独特之处在于对原始材料RNA的用量无需特殊处理，减少样品的用量，实验过程简单易行，获得全长cDNA的含量较高[14]。SMART法设计思路固然巧妙，但也不免存在一定的缺陷，例如基因内部的寡聚dC影响全长cDNA加尾效率，导致文库文库中全长cDNA的比例有所下降，使文库缺乏代表性。其次PCR具有“选择性扩增”的缺陷，不利于长片段序列的扩增，致使一些大于3 000bp的基因无法完全扩增出来，导致文库冗余性过强。

为使SMART法更加完善，许多研究者对该技术进行改进。例如Chenchik[15]在原有实验基础上，将MnCl2及BSA引入到单链cDNA合成的缓冲液中以此提高反转录的延伸效率。也有人通过减少LD–PCR扩增的循环参数，将循环参数设置在20–22 cycle从而保证全长基因在文库中所占比例，降低文库冗余程度[16]。而Wellenreuther等人通过将琼脂糖电泳分级技术与SMART法结合，提高文库中全长cDNA的比例，该方法[17]现已得到广泛应用且倍受各领域研究者们青睐。

文章来源：《植物遗传资源学报》 网址: http://www.zwyczyxbzz.cn/qikandaodu/2021/0308/560.html

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